抗体是研究和临床诊断中不可或缺的工具，可作为抗原（能够引发免疫反应的分子）的高度特异性检测器。定制抗体开发是指针对特定目标抗原的抗体的生成，该抗体可能在目录中不可用。这种方法使研究人员能够精确和特异地研究新的蛋白质、翻译后修饰或独特的分子。定制抗体的重要性不仅限于基础研究，在治疗干预、疫苗开发和诊断检测中发挥着至关重要的作用。
本指南介绍了开发过程中涉及的必要步骤，包括抗原设计、免疫、杂交瘤生成或重组展示技术、抗体生产、纯化、表征，以及最后的应用和未来展望。了解每个阶段对于成功开发满足特定研究或临床需求的抗体至关重要。
A. 抗原设计
定制抗体开发的第一步是靶抗原的选择和设计。抗原通常是引起免疫反应的蛋白质或肽，导致抗体的产生。选择标准包括抗原的免疫原性、表位的可及性、跨物种的保守性以及抗原与研究目标的相关性。
抗原设计通常涉及生物信息学工具来识别表位 – 抗体识别的抗原的特定部分。这些工具，如同源性建模，分析蛋白质结构和序列，以精确定位表位 – 抗体可以结合的靶抗原上的确切区域。这使得研究人员能够确定最有希望的抗体开发领域，即使靶蛋白的完整3D结构尚不清楚。
为了生产设计的抗原，肽合成等技术提供了一种快速且通用的方法，用于创建模拟特定表位的短氨基酸链。这对于初始测试很有用，但可能无法完全捕获抗原的天然 3D 形状，这对于最佳抗体结合至关重要。对于更复杂和更真实的抗原，采用重组蛋白表达。在这里，编码所需抗原或特定表位的基因被引入宿主细胞。然后，宿主细胞机器产生蛋白质，从而产生更大且结构准确的抗原。这些方法允许掺入修饰以增强免疫原性或模拟翻译后修饰。
抗原呈递给免疫系统会显着影响免疫结果。这可能涉及与载体蛋白偶联、封装在纳米颗粒中或掺入佐剂中以增强免疫原性。呈递方法的选择取决于抗原的性质和所需的免疫反应类型。
B. 免疫接种
免疫动物物种的选择受几个因素的指导，包括与人类的系统发育距离（用于产生与人类蛋白质交叉反应的抗体）、动物的大小和伦理考虑。虽然小鼠很容易获得并且经过充分研究，但它们与人类的遥远进化关系有时会导致抗体对人类蛋白质不起作用。大规模生产有利于山羊或绵羊等大型动物，它们可以产生更多的抗体。兔子提供强烈的抗体反应，但它们的抗体会引发人类不必要的免疫反应。最终，研究人员会考虑所有这些因素，以及对动物福利的伦理问题，以选择最适合开发抗体的物种。
有效的免疫方案是为诱导强大和持续的免疫反应而量身定制的。这涉及多次注射抗原，间隔数周或数月，并通过血清检测仔细监测动物的免疫反应。酶联免疫吸附测定 （ELISA） 是一种常见的血清学测定法，用于测量血液中抗原特异性抗体的滴度。这种监测使研究人员能够评估免疫方案的有效性，并确定是否需要进行调整，例如改变抗原剂量或引入佐剂。
佐剂是增强人体对抗原的免疫反应的物质。选择合适的佐剂至关重要，因为它会影响免疫反应的程度和类型。有多种佐剂可供选择，每种佐剂都有不同的作用机制。例如，明矾是一种常用的佐剂，可刺激抗体的产生，而弗洛因德的佐剂虽然非常有效，但由于安全问题，不再广泛使用。
C. 杂交瘤的产生（用于单克隆抗体）
免疫成功后，从宿主动物脾脏中分离出B细胞并与不朽的骨髓瘤细胞融合。这种体细胞融合产生杂交瘤细胞，将骨髓瘤细胞的永生性与B细胞产生特异性抗体的能力相结合，从而可以连续产生单克隆抗体。
然后筛选杂交瘤产生所需抗体的能力。这涉及各种检测方法，例如 ELISA，以识别那些产生与靶抗原特异性结合的抗体的细胞。对选定的杂交瘤进行扩展和进一步测试，以确保其特异性和亲和力。克隆杂交瘤，通常使用限制性稀释，以确保每个克隆都来自单个细胞，保证单克隆性，以便以后收获抗体以进行进一步表征。
D. 噬菌体展示或酵母展示（用于重组抗体）
重组抗体技术（如噬菌体或酵母展示）为杂交瘤技术提供了一种强大的抗体发现替代方案，并涉及构建显示在噬菌体或酵母表面的抗体片段文库。这些文库由免疫动物或人类 B 细胞生成，也可以是合成的，提供多种抗体序列。通过称为生物淘洗的过程筛选文库中的靶抗原结合剂。这涉及与抗原的多轮结合，洗去非结合剂，并扩增结合剂，富集对抗原具有高亲和力的序列。
然后对选定的抗体片段进行分离、测序和进一步表征。在某些情况下，这些片段被转化为全长抗体，用于详细的功能研究。此步骤可确保抗体不仅结合抗原，而且在所需的应用中具有功能活性，例如中和毒素或刺激免疫反应。
E. 抗体生产
对于大规模生产，杂交瘤细胞或重组表达系统（例如大肠杆菌、酵母或哺乳动物细胞）的培养条件针对氧含量、温度和培养基组成进行了优化，以最大限度地提高抗体产量。使用蛋白 A 或 G 亲和层析等技术从培养基中纯化抗体，这些技术利用抗体的 Fc 区进行选择性结合。也可以采用离子交换色谱法或尺寸排阻色谱法等其他纯化步骤来达到高纯度水平。
质量控制包括对抗体进行严格的特异性、亲和力和无污染物测试。验证检测（如 ELISA、蛋白质印迹和免疫荧光）证实了抗体在其预期应用中的效用。例如，可以在细胞培养中测试旨在中和病毒的抗体，以评估其预防病毒感染的能力。
F. 抗体表征
进行表征测定以确定抗体的特异性（仅与靶抗原结合的能力）和亲和力（结合强度）。高特异性和亲和力对于抗体在研究和诊断应用中的有效性至关重要。此外，功能测定（包括中和试验、流式细胞术和免疫沉淀）可评估抗体在生物学环境中的性能。这些检测可确保抗体不仅能识别抗原，而且在实验或诊断程序中也能发挥预期的作用。验证了抗体在各种储存和处理条件下的稳定性及其跨批次的重现性。这确保了在不同环境中随时间推移的一致性能，这是研究和商业应用的关键方面。